人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建及体外亲和筛选
作者： 王晗 [1,2] ; 于蕊 [1] ; 张晓鹏 [1] ; 任军 [1] ; 谢娜 [3] ; 樊红艳 [1] ; 张金龙 [1] ; 房婷 [1] ; 于长明 [1] ; 陈薇 [1]
摘要：目的构建人破伤风免疫噬菌体单链抗体库，筛选抗破伤风毒素重链c端（TeNT-He）的特异性单链抗体（scFv）。方法利用RT—PCR从5名破伤风抗体滴度较高的健康献浆员外周血淋巴细胞中获得全套人破伤风抗体V。和V。基因，经过重叠PCR将V。和V。基因连接获得scFv片段。将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体，电转化大肠TG，感受态菌，获得抗体库。以TeNT—Hc为抗原对抗体库进行3轮筛选，获得特异性人源性抗TeNT_Hc单链抗体。scFv由pET32a（＋）表达载体表达，产物包涵体采用HisTrapFF预装柱纯化并透析复性。采用非竞争酶免疫实验法测定scFv亲和常数（affinityconstant，KD值）。检测scFv抑制TeNT—Hc与神经节苷脂GTlh结合的体外中和活性，计算抑制率。结果构建库容量为1×10。的人破伤风免疫噬菌体单链抗体库，经过筛选获得3株特异性较好的人源性抗TeNT—He单链抗体。原核表达结果显示，3株scFv均以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的40％～45％。包涵体经洗涤、纯化和复性后，scFv均保持了与TeNT-Hc的特异结合活性，1L培养物经纯化后可获得4～6mgscFv蛋白。亲和力测定结果，27G、22D和S-4-7H—scFv的KD值分别为（1．25×10^-7），（2．31×10^-7）和（1．97×10^-7）mol／L。3株抗体对TeNT-Hc与神经节苷脂GTlh结合的抑制率分别为64．5％，58．6％和51．5％。结论人破伤风免疫噬菌体单链抗体库的构建及具有体外中和活性的特异性抗TeNT—Hc单链抗体的获得，为人破伤风基因工程中和抗体的制备奠定了良好基础。
关键字： 破伤风 破伤风毒素 单链抗体 逆转录聚合酶链反应 细菌噬菌体